Las micelas de caseína pueden coagular por la acción de ezimas proteolíticos, que cortan la cadena de la proteína por el enlace entre Phe105-Met106, separando la región hidrofílica del extremo
El fragmento mayor de la caseina kappa, que va desde el aminoácido 1 al 105, conocido como "para-kappa-caseína", queda asociado a la micela, mientras que el fragmento menor, el "caseinomacropéptido", se libera y queda en solución. Tras la coagulación de las micelas, este fragmento pèrmanecerá en el lactosuero.
Quimosina
La quimosina, cuyo código es E.C.3.4.23.4, es un enzima proteolítico que se obtiene tradicionalmente del abomaso (cuarto estómago) de terneros jóvenes. Se encuentra, como enzima digestivo, mezclada con pepsina, siendo la proporción de quimosina, y la calidad del cuajo, mayor cuanto más joven es el animal. También se encuentra en otras especies animales, como el cerdo. Durante muchos siglos se ha utilizado como en la fabricación de queso el estómago de los terneros secado al sol y triturado.
En la década de 1870, Christian Hansen obtuvo la primera preparación de quimosina relativamente pura, y de calidad constante de un lote a otro, fundando una compañía para su comercialización, que lleva su nombre y que todavía es una de las más importantes en la fabricación de enzimas para la industria alimentaria. Comercializó la quimosina disuelta en una solución salina concentrada, tal como se continúa haciendo actualmente.
La quimosina se sintetiza como pre-pro-quimosina, proteína que tiene en su cadena 58 aminoácidos más que la quimosina activa, y que no tienen actividad proteolítica. Se secreta al estómago como pro-quimosina, también inactiva, tras el corte de 16 aminoácidos, y se transforma en el enzima activo por la eliminación proteolítica de otro fragmento de 42 aminoácidos, quedando con un peso molecular de aproximadamente 30.700. El enzima, como todas las proteinasas, puede autodigerirse si se conserva en las condiciones en las que es activo. Puesto que la quimosina se inactiva reversiblemente con concentraciones elevadas de cloruro de sodio, se conserva en esta forma. Al disminuir la concentración salina al utilizarla, se reactiva.
Estructura de la quimosina
El centro activo de la quimosina, como el de otras aspartil-proteinasas, está situado en un profundo bucle entre dos dominios.
En ese centro activo se encuentran los dos restos de aspártico catalíticos, el que ocupa el lugar 34 en la cadena y el 216.
Además, intervienen también algunos átomos de thre-35, gly-36, thr-217 y gly-218 (señalados en azul).
La selectividad de substrato de la quimosina viene determinada por presencia de una zona específica con cargas negativas (señalada en verde), que interacciona con las histidinas que ocupan las posiciones 98, 100 y 102 en la caseina kappa.
La quimosina tiene tres variantes genéticas, la variante A, con un resto de aspártico en la posición 286, y la B, que tiene en esa misma posición un resto de glicina y la variante C.
La variante A es algo más activa que la B frente a la caseína kappa, posiblemente porque la carga del aspártico favorece su interacción con ellla. En cambio, la variante B es algo más estable a pH 3,5 o inferior.
Junto con la quimosina, en el cuajo aparece pepsina. Este enzima, obtenido de bovinos adultos o de cerdos, también puede utilizarse en la coagulación de la leche.
Quimosina recombinante
El desarrollo de las técnicas de ingeniería genética, junto con la demanda, no siempre satisfecha, de quimosina de calidad, han inducido a la producción de quimosina utiliazando microrganismos en cuyo genoma se ha insertado el gen de la pro-quimosina bovina. La cadena polipeptíidca es evidentemente la misma que la de la quimosina bovina, pero la glicosilación es distinta.
La primera quimosina recombinante se obtuvo en 1988, en
Quimosina B, en la levadura Kluyveromyces lactis (o Kluyveromyces marxianus var. lactis), con el nombre comercial de "Maxiren" (de la empresa Gist-Brocades). Se sintetiza en forma de pro-quimosina, que se activa tras el lisado de las células, unas vez detenida la fermentación.
Quimosina B en el hongo filamentoso Aspergillus awamori (o Aspergillus niger var. awamori). Gen de la proquimosina. Se segrega al medio de cultivo, de donde se recupera.
Quimosina A en Escherichia coli k-12
Quimosina B en Pichia pastoris, otra levadura
En Escherichia coli la proquimosina se almacena en cuerpos de inclusión, siendo necesario destruir la células microbians y solubilizar el enzima.
Pueden encontrarse detalles del proceso de modificación genética de los microrganismos, extracción y ensayos toxicológicos en IPCS Inchem
La quimosina recombinante ha encontrado problemas burocráticos en la Unión Europea (debería considererase un cuajo animal o un cuajo microbiano?), especialmente en los quesos con denominación de origen, para los que no está autorizada generalmente.
En Alemania se autorizó su uso en la fabricación de quesos comunes en 1997.
Dado que las características de la quimosina de cada especie parecen estar adaptadas a las de las propias caseínas, se ha obtenido también quimosina de camello, para utilizarla en la coagulación de esta leche, que se comporta particularmente mal frente a la quimosina de vaca.
Pueden encontrarse más detalles en: Camelgate
Cuajos microbianos
Los problemas de suministro de cuajo animal y la expansión de la industria del queso a partir de la década de 1940 forzaron la búsqueda de enzimas alternativas al cuajo animal.La primera proteinasa microbiana utilizada fue la de Mucos pusillus, pero presenta el problema de que es más activa que el cuajo de ternero.
En la fabricación de quesos industriales se utilizan habitualmente proteinasas obtenidas de microorganismos en lugar del cuajo animal.
Una de las más utilizadas es la proteinasa de Rhizomucor miehei, que es también una aspartil-proteinasa, como la quimosina.
El centro activo de la proteinasa de Rhizomucor miehei, como el de otras aspartil-proteinasas, está situado en un profundo bucle entre
los dos dominios. En ese centro activo se encuentran los dos restos de aspártico catalíticos, el que ocupa el lugar 38 en la cadena y el 237.
La proteinasa de Rhizomucor miehei es la más glicosilada de todas las aspertil-proteinasas conocidas. Probablemente, esta es la razón de que sea particularmente termorresistente.
También se utiliza en la elaboración de quesos la proteinasa de Cryphonectria parasitica (antes conocido como Endothia parasitica). Al contrario que la anterior, es muy termolábil, por lo que se destruye en la etapa de calentamiento de quesos como el Emmental. En quesos no calentados, puede dar problemas al fragmentar la caseína beta. Menos importante es la proteinasa de Bacillus subtilis
Cuajos vegetales
Muchos vegetales contienen proteinasas capaces de coagular las caseínas. Algunas de estas proteinasas se utilizan en la elaboración de quesos tradicionales, especialmente en Portugal y en el Mediterráneo, incluyendo el sur de España. Entre ellas destaca la obtenida de la flor de cardo (cardón, o alcaucil), Cynara cardunculus, que se utiliza en la elaboración de los quesos extremeños con Denominación de Origen "Torta del Casar" y "La Serena", y en los portugueses "Serra da Estrela". También se utiliza en Canaria, en la elaboración del "Flor de Guía". La preparación enzimática se obtiene artesanalmente macerando los pistilos de la flor con agua.
La flor del cardo Cynara humilis también contiene proteinasas, que son más semejantes a la pepsina que a la quimosina en cuanto a su actividad.
También se utiliza en la coagulación de la leche, y desde hace muchos siglos (está citada en el Liber Animalium de Aristóteles), la proteinasa del látex de la higuera. Otras proteinasas coagulantes se encuentran en el lampazo (Herculeum spondylum) y en la llamada "hierba cuajadera", Galum verum.
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